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南京信帆生物:糖芯片分析實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)
更新時(shí)間:2016-04-22   點(diǎn)擊次數(shù):1595次

生物通報(bào)道:細(xì)胞表面的由脂質(zhì)和蛋白組成的糖體分子蘊(yùn)藏著許多奧秘,決定了細(xì)胞如何發(fā)育,如何相互作用以及溝通。細(xì)菌和病毒也就是粘附在這些線性或帶分枝寡糖(glycan)上感染細(xì)胞的,免疫系統(tǒng)要進(jìn)行反擊,也需要首先學(xué)會識別微生物上的糖殼,展開先天和后天的防御。

經(jīng)過多年的探索,科學(xué)家們已經(jīng)掌握了不少糖體分子的基本生物學(xué)特征,但是比較于DNA和蛋白,我們對于這些分子的了解還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,然而由于糖體結(jié)構(gòu)復(fù)雜,要想構(gòu)建出這種分子非常困難,而且與DNA不同,糖體幾乎是不可能克隆和擴(kuò)增的,因此數(shù)量也是有限。

近年來一種用于分析遺傳物質(zhì)的新技術(shù)被證明適用于糖生物學(xué),這就是芯片技術(shù)。*個(gè)糖芯片誕生于2002年,也就是在芯片技術(shù)問世后,用于研究基因表達(dá)后的第7個(gè)年頭。

糖芯片由少量多種類的天然或合成的低聚糖組成,研究人員利用這種芯片能識別結(jié)合在糖上的蛋白,細(xì)胞和微生物。由于芯片制作只需要極少量的糖分子,因此這種技術(shù)得以能進(jìn)行蛋白糖親和性的廣泛篩選。

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目前有十幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建自己的糖芯片,隨著更多的糖分子被分離和合成出來,這些芯片將會不斷完善。目前制造生物試劑zui大及zui多糖芯片的是一個(gè)性的研究協(xié)會:功能糖組學(xué)協(xié)會(Consortium for Functional Glycomics,CFG,生物通譯),以及英國倫敦帝國學(xué)院的糖科學(xué)實(shí)驗(yàn)室,其它一些實(shí)驗(yàn)室則主要是針對自己的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行小規(guī)模的制作。

“在這一點(diǎn)上我認(rèn)為沒有什么單個(gè)平臺的贏家”美國國家癌癥研究所化學(xué)糖生物學(xué)組組長Jeffrey Gildersleeve說。

由于RNA測序價(jià)格下降,DNA芯片已不再像以前那樣受到矚目,但糖芯片的未來卻被看好,“我認(rèn)為未來五年里,(糖芯片)就會開始商業(yè)化,進(jìn)入工業(yè)應(yīng)用和應(yīng)用領(lǐng)域,”埃默里大學(xué)醫(yī)學(xué)院功能糖組學(xué)國家中心(NCFG,生物通譯)主任Richard Cummings說。

糖芯片制備原理

糖芯片的制備原理與基因芯片,蛋白芯片相似,是將多種微量的糖類化合物以點(diǎn)陣的形式固定在某種材料制作的底片上,采用高通量掃描技術(shù)和熒光染色等手段分析和檢測糖分子與其它生物大分子之間的特異性結(jié)合,進(jìn)而研究其生物功能和作用機(jī)制。

糖芯片具有檢測樣品用量少,特異性高,高敏感性,高通量和穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn),的提高了糖化學(xué)研究的效率,這種芯片可以分成單糖或二糖芯片,寡糖芯片,多糖芯片和復(fù)合式芯片,另外根據(jù)用途不同也可以分成功能糖組學(xué)芯片,藥物開發(fā)糖體芯片和糖抗原免疫診斷芯片等。

制備糖芯片的方法有非化學(xué)修飾糖類固定和化學(xué)修飾糖類固定,前者通過點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣將糖直接固定在玻片上,屬于非特異性結(jié)合,這種方法無需對糖基進(jìn)行修飾。但是由于糖類化合物的性質(zhì),如分子量,空間結(jié)構(gòu),溶解性,反應(yīng)位點(diǎn)等都不同,因此有些糖類化合物無法直接以非共價(jià)結(jié)合的方式直接固定在固體介質(zhì)上,為此科學(xué)家們就需要對糖進(jìn)行化學(xué)修飾,即嫁接上能與載體表明產(chǎn)生特異性結(jié)合的基團(tuán),然后再固定。

糖芯片與其它技術(shù)的結(jié)合

糖芯片將糖分子通過共價(jià)或非共價(jià)作用固定于經(jīng)化學(xué)修飾的基質(zhì)上, 進(jìn)而對糖蛋白等待測樣品或糖分子探針本身進(jìn)行測試、分析。與芯片上糖探針存在特異作用的樣品分子被吸附, 其他無特異作用的分子則在清洗液的沖洗下被洗掉。通過熒光染色等檢測方法可以簡單、快速地篩選出存在特異作用的分子,從而在分析糖蛋白結(jié)構(gòu)和功能等方面起到重要作用。

質(zhì)譜技術(shù)是目前糖生物學(xué)家應(yīng)用的測定糖鏈結(jié)構(gòu)的工具。快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)、 電噴霧質(zhì)譜(ES-MS)、基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行質(zhì)譜是在糖鏈結(jié)構(gòu)測定方面應(yīng)用廣泛的3種質(zhì)譜,它們可以直接對樣品進(jìn)行離子化和解析作用以獲得信息, 而且可以完整的糖復(fù)合物或片段化的樣品進(jìn)行分析。

在利用糖芯片的同時(shí), 可以聯(lián)合利用質(zhì)譜技術(shù), 來分析糖蛋白等待測樣品或糖分子探針的具體結(jié)構(gòu)。例如, 利用DNA芯片點(diǎn)樣儀將糖抗原點(diǎn)印在化學(xué)修飾的玻片上。然后把芯片與待測樣品溫浴, 此時(shí), 待測樣品中的配體就會與芯片上的糖分子結(jié)合, 而后用類 似于蛋白質(zhì)芯片中所用的免疫檢測技術(shù)進(jìn)行染色分析, 如用抗體 ( 單抗或多抗血清 )或其他糖結(jié)合蛋白 (凝集素、 細(xì)胞因子等 )進(jìn)行免疫染色。經(jīng)抗體染色的玻片可以用生物芯片掃描儀檢測熒光信號, 并借助于計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析, 得出有效的熒光信號。zui后, 在有效熒光信號所 對應(yīng)糖芯片的原位進(jìn)行質(zhì)譜分析, 分析其具體結(jié)構(gòu)。

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