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記住這6點，教您做好免疫組化實驗！

一、為達到免疫組織化學技術的要求，組織固定越新鮮越好。

在免疫組化zui后結果的判斷時，常可見到均勻一片的似非特異性染色的現象，經多方研究認為，它是一種假性非特異性的染色。因為腫瘤組織中含有的抗原較易發生擴散彌散，腫瘤細胞無限制的生長和生長過速，導致腫瘤中間部分組織血液供給困難，造成缺血壞死，壞死細胞中的抗原由于機體的作用，可以被均勻地散布于細胞與細胞間的間質，這是抗原發生彌散的一種方式。另一種抗原彌散的方式就是，由于組織沒有及時的固定所引起的。離體的組織不及時固定，組織就會自溶，抗原就會擴散，這是一非常普通的常識，但要做好卻是極不容易。標本從外科切除到浸入固定液需要經過一段時間，在這段時間里，有的抗原就可以發生擴散。雖然已浸入了固定液，但標本較大，固定液的量又不足，當然由于固定液的滲透需要時間，當滲入到組織之中時，中間的細胞已發生了變化，抗原也隨著發生擴散，這種現象在產酶多的器官是比較明顯的，如胃癌，當切除后標本較大，雖然在手術室期間已放入了固定液，但固定液要透過肌層達到胃粘膜面起碼需要幾個小時的時間，當固定液發揮作用時，組織已經發生變化。因此，這了達到免疫組織化學染色的要求，對于離體的組織盡量快的進行固定，有條件的應將其剖開，早取材，早固定。

二、組織脫水必須*干凈
組織塊取材不能太大過厚，才能較好地完成脫水的過程。如果取材太厚，在較短的時間內脫水不*，將可引起一系列的問題，比如浸蠟不*，切片不好完成，切不完整。由于先天不足，導致后來切片染色的脫落，造成染色的失敗，或者由此反復操作，造成年人力物力的浪費，造成病理報告的延期發出等。因此，對取材的要求是除了要求要有藝術性外，即平整、外觀好看，還要求適中。

三、切片必須完整、均勻、平展、無鄒折
應用于免疫組織化學染色的切片，對切片的質量要求較高，切片必須完整，平展、無汽泡，無鄒折，這樣有利在染色時的沖洗，有利于切片的牢固附貼。如果切片不平展，免疫組化染色后，可出現染色不均勻的現象，顏色深淺不一， 不平。如果切片有汽泡切片在烘烤時，由于汽泡的破裂影響了汽泡周圍的組織，在其周圍可觀察到深淺不一的染色。如果切片有鄒折，免疫組化染色后，在鄒折的地方有深淺不一的顏色，這是一種假陽性，容易引走混淆。

四、切片的附貼必須牢固，必須使用合適的粘貼劑。
免疫組織化學染色前的前期準備工作，就是必須對新的載玻片進行處理，新的載玻片表面看起來很干凈，有人認為不需要進行任何的處理，都能夠適合使用，這是一種錯誤的想法。新出廠的載玻片，表面復蓋著開一層油脂樣的物質，如果不加以處理，對切片的附貼是極為不利的。我們的做法是：新的載玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小時甚至過夜，然后取出，經自來水*沖洗后，浸入酒精中達2小時以上，取出擦干備用或烘干也可。然后再將載玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀釋液（1：50用丙酮或無水乙醇稀釋都可以）中硅化10分鐘，后經無水乙醇洗2次，烘干即可使用。

五、切片必須烘烤附貼牢固，既要經得起抗原修復時高溫的作用而不使輕易脫片，又不至于破壞抗原。
應用于免疫組化染色的切片。由于整個過程需經幾個階段的處理，如抗原修復時抗原修復液的沸騰且需持續十幾分鐘，PBS的反復沖洗，有的甚至于4℃冰箱中孵育達十幾小時。因此，對切片的質量要求很高，尤其是切片的附貼程度。以往有人主張切片在60℃以下烘烤30-60分鐘即可按此進行結果是切片掉片嚴重，切片松動率占。切片究竟烘烤多長時間才合適，既不脫片和適合各項要求，又不至于破壞抗原。幾組實驗［］診斷P173認為，切片在60℃的恒溫干燥箱中烘烤2-5小時zui為合適。這是因為：抗原可耐受如此的溫度，病理科一般使用的石蠟，其熔點在60℃左右，組織浸蠟時，浸蠟箱中的溫度，一般都調在65℃左右，組織在這樣溫度中要浸泡2小時以上，才能達到*地浸蠟。組織中的抗原已經受了65℃的溫度考驗，保存下來的抗原，都已具有耐熱性。另外，經上述時間烘烤出來的切片，附貼牢固，抗原保存好，染色成功率達，保證了病理診斷的及時性和準確性。
特需要注意的是，不管是應用于診斷的切片還是研究用的切片，烘烤后應盡快進行染色。如果切片切完后，遲遲不進行染色，存放于室溫中或工作冰箱中，切片中的抗原將會隨著時間的延長而逐漸消失，甚至出現假陰性。原則上是新鮮切片，即行染色，染多少張切多少張，這樣才能盡可能的保存表達更多的抗原。

六、切片脫蠟必須干凈，否則將會影響免疫組化染色的zui后結果。
蠟不溶于水，不與其它的使用的抗體相融合。它只能靠特用的試劑，處理足夠的時間，才能將其除去。如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會引起許多弊病，如染色不均勻，陽性物時隱時現，真假難辨，背景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色前必須*脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強，脫蠟時間較短。較受使用者的青睞。脫蠟的時間要根據季節，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時間不需很多，3-5分鐘就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時間需要延長，10-20分鐘或更長。總之，操作時應根據不同的季節，不同的室溫，不同的試劑來決定，脫蠟的時間，原則上是要*，干凈，*地脫去切片上的蠟。為了做到這一步，切片在脫蠟前的加溫將有助于完成上述的要求。比如：當天切的切片，燒烤2小時后進行染色，切片帶有溫度進行脫蠟這將可加速脫蠟的過程，如果預先切好烤好的切片，在染色前，還必須對切片進行加溫10-20分鐘，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果魁偉更好

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